Un método diseñado basado en CRISPR que encuentra ARN del SARS-CoV-2, el virus que causa el COVID-19, promete hacer que las pruebas para esa y otras enfermedades sean rápidas y fáciles.

Los colaboradores de la Universidad de Rice y la Universidad de Connecticut diseñaron aún más el sistema CRISPR-Cas13 de edición de ARN para aumentar su poder para detectar cantidades diminutas del virus SARS-CoV-2 en muestras biológicas sin el paso de amplificación y extracción de ARN que consume mucho tiempo necesario en Pruebas de PCR estándar de oro.

La nueva plataforma tuvo un gran éxito en comparación con la PCR, ya que encontró 10 de 11 positivos y ningún falso positivo para el virus en pruebas en muestras clínicas directamente de hisopos nasales. Los investigadores demostraron que su técnica encuentra signos de SARS-CoV-2 en concentraciones atomolares (10-18).

El estudio dirigido por el ingeniero químico y biomolecular Xue Sherry Gao en la Escuela de Ingeniería George R. Brown de Rice y los investigadores postdoctorales Jie Yang de Rice y Yang Song de Connecticut aparece en Nature Chemical Biology.

Cas13, como su primo más conocido Cas9, es parte del sistema por el cual las bacterias se defienden naturalmente contra los fagos invasores. Desde su descubrimiento, los científicos han adaptado CRISPR-Cas9 para editar genomas de ADN vivo y se muestra muy prometedor para tratar e incluso curar enfermedades.

Y se puede utilizar de otras maneras. Cas13 por sí solo se puede mejorar con ARN guía para encontrar y cortar secuencias de ARN objetivo, pero también para encontrar «colateral», en este caso, la presencia de virus como el SARS-CoV-2.

«La proteína Cas13 diseñada en este trabajo se puede adaptar fácilmente a otras plataformas previamente establecidas», dijo Gao. «La estabilidad y solidez de las variantes Cas13 diseñadas las hacen más adecuadas para el diagnóstico en el punto de atención en áreas de bajos recursos cuando no se dispone de costosas máquinas de PCR».

Yang dijo que el Cas13 de tipo salvaje, extraído de una bacteria, Leptotrichia wadei, no puede detectar un nivel attomolar de ARN viral en un período de 30 a 60 minutos, pero la versión mejorada creada en Rice hace el trabajo en aproximadamente media hora y detecta el SARS. -CoV-2 en concentraciones mucho más bajas que las pruebas anteriores.

Ella dijo que la clave es un bucle de horquilla flexible y bien escondido cerca del sitio activo de Cas13. «Está en el medio de la proteína cerca del sitio catalítico que determina la actividad de Cas13», dijo Yang. «Dado que Cas13 es grande y dinámico, fue un desafío encontrar un sitio para insertar otro dominio funcional».

Los investigadores fusionaron siete dominios de unión de ARN diferentes al bucle, y dos de los complejos fueron claramente superiores. Cuando encontraran sus objetivos, las proteínas brillarían, revelando la presencia del virus.

«Pudimos ver que el aumento de la actividad fue cinco o seis veces mayor que el Cas13 de tipo salvaje», dijo Yang. «Este número parece pequeño, pero es bastante sorprendente con un solo paso de ingeniería de proteínas.

«Pero eso aún no fue suficiente para la detección, por lo que cambiamos todo el ensayo de un lector de placas de fluorescencia, que es bastante grande y no está disponible en entornos de bajos recursos, a un sensor electroquímico, que tiene una sensibilidad más alta y puede usarse para análisis puntuales». diagnósticos de atención», dijo.

Con el sensor listo para usar, Yang dijo que la proteína diseñada fue cinco órdenes de magnitud más sensible para detectar el virus en comparación con la proteína de tipo salvaje.

El laboratorio quiere adaptar su tecnología a tiras de papel como las de las pruebas caseras de anticuerpos contra la COVID-19, pero con una sensibilidad y precisión mucho mayores. «Esperamos que eso haga que las pruebas sean más convenientes y con un costo más bajo para muchos objetivos», dijo Gao.

Los investigadores también están investigando la detección mejorada de los virus Zika, dengue y Ébola y los biomarcadores predictivos de enfermedades cardiovasculares. Su trabajo podría conducir a un diagnóstico rápido de la gravedad de la COVID-19.

«Diferentes virus tienen diferentes secuencias», dijo Yang. «Podemos diseñar una guía de ARN para apuntar a una secuencia específica que luego podemos detectar, que es el poder del sistema CRISPR-Cas13».

Pero debido a que el proyecto comenzó justo cuando se apoderó de la pandemia, el SARS-CoV-2 fue un foco natural. «La tecnología es bastante adecuada para todos los objetivos», dijo. “Esto lo convierte en una muy buena opción para detectar todo tipo de mutaciones o diferentes coronavirus”.

«Estamos muy entusiasmados con este trabajo como un esfuerzo combinado de biología estructural, ingeniería de proteínas y desarrollo de dispositivos biomédicos», agregó Gao. «Aprecio mucho todos los esfuerzos de los miembros y colaboradores de mi laboratorio».

Los coautores del artículo son el investigador postdoctoral de Rice Xiangyu Deng, el estudiante universitario Jeffrey Vanegas y el estudiante graduado Zheng You; los estudiantes de posgrado Yuxuan Zhang y Zhengyan Weng de la Universidad de Connecticut; la supervisora ​​de microbiología Lori Avery y Kevin Dieckhaus, profesor de medicina de UConn Health; Yi Zhang, profesor asistente de ingeniería biomédica en la Universidad de Connecticut; y Yang Gao, profesor asistente de biociencias en Rice.

Xue Sherry Gao es profesora asistente de Ted N. Law de ingeniería química y biomolecular en Rice.

La Fundación Nacional de Ciencias (2031242, 2103025), la Fundación Welch (C-1952, C-2033-20200401) y el Instituto de Investigación y Prevención del Cáncer de Texas (RR190046) apoyaron la investigación.