Cuando las bacterias son atacadas por un virus, pueden defenderse con un mecanismo que rechaza el material genético introducido por el intruso. La clave son los complejos de proteínas CRISPR-Cas. Es solo en la última década que se ha descubierto y dilucidado su función para la inmunidad adaptativa en microorganismos. Con la ayuda de un ARN incrustado, los complejos CRISPR reconocen una secuencia corta en el ADN del atacante. Desde entonces, el mecanismo de reconocimiento de secuencias por ARN se ha utilizado para desactivar y modificar genes de forma selectiva en cualquier organismo. Este descubrimiento revolucionó la ingeniería genética y ya fue honrado en 2020 con el Premio Nobel de Química otorgado a Emmanuelle Charpentier y Jennifer A. Doudna.
Sin embargo, en ocasiones, los complejos CRISPR también reaccionan a segmentos de genes que difieren ligeramente de la secuencia especificada por el ARN. Esto conduce a efectos secundarios indeseables en aplicaciones médicas. « Las causas de esto aún no se comprenden bien, ya que el proceso no se pudo observar directamente hasta ahora », dice Dominik Kauert, quien trabajó en el proyecto como estudiante de doctorado.
Procesos a nanoescala rastreados en detalle
Para comprender mejor el proceso de reconocimiento, el equipo dirigido por el profesor Ralf Seidel y Dominik Kauert aprovechó el hecho de que la doble hélice del ADN de la secuencia objetivo se desenrolla durante el reconocimiento para permitir el emparejamiento de bases con el ARN. « La pregunta central del proyecto era, por lo tanto, si el desenrollado de una pieza de ADN que tiene solo 10 nanómetros (nm) de largo podría rastrearse en tiempo real », dice Kauert.
Para observar el proceso de desenrollado en detalle, los científicos tuvieron que hacerlo visible al microscopio. Para lograr este objetivo, el equipo se basó en los logros de la nanotecnología del ADN, que se puede utilizar para crear cualquier nanoestructura de ADN tridimensional. Usando esta técnica llamada origami de ADN, los investigadores construyeron un brazo de rotor de ADN de 75 nm de largo con una nanopartícula de oro unida a su extremo. En el experimento, el desenrollamiento de la secuencia de ADN de 2 nm de espesor y 10 nm de largo se transfirió a la rotación de la nanopartícula de oro a lo largo de un círculo con un diámetro de 160 nm; este movimiento se puede ampliar y rastrear utilizando una configuración de microscopio especial.
Con este nuevo método, los investigadores pudieron observar el reconocimiento de secuencias por parte del complejo CRISPR Cascade casi par de bases por par de bases. Sorprendentemente, el emparejamiento de bases con el ARN no es energéticamente ventajoso, lo que significa que el complejo solo se une de manera inestable durante el reconocimiento de la secuencia. Solo cuando se reconoce la secuencia completa se produce una unión estable y el ADN se destruye posteriormente. Si es la secuencia objetivo « incorrecta », el proceso se cancela.
Los hallazgos ayudarán a seleccionar secuencias de ARN adecuadas
El hecho de que el proceso de reconocimiento produzca en ocasiones resultados incorrectos se debe a su naturaleza estocástica, es decir, a movimientos moleculares aleatorios, como ahora han podido demostrar los investigadores. « El reconocimiento de secuencias está impulsado por las fluctuaciones térmicas en el emparejamiento de bases », dice Kauert. Con los datos obtenidos, fue posible crear un modelo termodinámico de reconocimiento de secuencias que describe el reconocimiento de segmentos de secuencias desviadas. En el futuro, esto debería permitir una mejor selección de secuencias de ARN que reconozcan solo la secuencia objetivo deseada, optimizando así la precisión de la manipulación genética.
Dado que los nanorotores diseñados son universales en cuanto a su idoneidad para medir giros y pares en moléculas individuales, también se pueden utilizar para otros complejos CRISPR-Cas o biomoléculas.
El trabajo fue financiado por el Consejo Europeo de Investigación y la Fundación Alemana de Investigación y se llevó a cabo en colaboración con el grupo de investigación del profesor Virginijus Siksnys de la Universidad de Vilnius en Lituania, quien aisló y proporcionó los complejos CRISPR utilizados.