Se han administrado más de doce mil millones de dosis de vacunas de ARNm en todo el mundo desde el comienzo de la pandemia de COVID, salvando millones de vidas. Pero las terapias basadas en ARN para otras enfermedades hasta ahora han demostrado ser más difíciles de desarrollar. La respuesta inmunitaria de todo el cuerpo causada por las vacunas de ARNm es fantástica para combatir los patógenos invasores, pero muchas otras afecciones solo afectan a un solo órgano o tipo de célula. Diseñar moléculas de ARN para que solo activen sus cargas terapéuticas cuando se encuentren en las condiciones adecuadas es la clave para la próxima generación de terapias « inteligentes » basadas en ARN.

Un nuevo sistema creado por investigadores del Instituto Wyss de la Universidad de Harvard y el MIT puede ayudar a desbloquear ese potencial, como se informa en Nature Communications. El equipo, trabajando en el laboratorio del miembro de la facultad de Wyss Core, Jim Collins, Ph.D. desarrolló un nuevo circuito de detección y respuesta de ARN que llaman Detección y amplificación de desencadenantes de ARN a través de ADAR, o DART VADAR. Aprovechando una enzima que edita el ARN en el cuerpo humano, DART VADAR permite a los investigadores diseñar fácilmente circuitos que desencadenan la traducción de una carga genética entregada en respuesta a la presencia de un marcador molecular específico de enfermedad y/o tipo de célula. Esta capacidad amplía el alcance de las condiciones que pueden abordarse con terapias basadas en ARN y permite el desarrollo de tratamientos altamente específicos para una variedad de enfermedades.

« Estoy particularmente emocionado por el hecho de que nuestro sistema DART VADAR es un circuito compacto basado en ARN clínicamente relevante que permite dirigir terapias de una manera altamente programable a tipos de células específicas y células en ciertos estados, minimizando así los efectos fuera del objetivo. « , dijo Collins, quien también es profesor Termeer de Ingeniería y Ciencias Médicas en el MIT.

Del disparador a la traducción a la terapia

The Collins Lab ha estado interesado durante mucho tiempo en encontrar formas de controlar la traducción de los ARN en las células y ha desarrollado varios métodos, incluidos eToeholds, que les permiten iniciar la traducción solo en presencia de una molécula « desencadenante » específica. Pero el proceso de diseñar una nueva estructura molecular para cada nuevo disparador fue engorroso y complicado. « Nuestra tecnología creció a partir de la idea de que podíamos desacoplar los elementos de los sensores de ARN sensibles (detección, activación, etc.) para que sea mucho más fácil diseñar circuitos para nuevos objetivos. Idealmente, queríamos poder cambiar la carga útil sin modificando el elemento sensor cada vez », dijo el coautor principal Raphaël Gayet, Ph.D. científico investigador del Instituto Wyss.

La sustancia alrededor de la cual se construye DART VADAR se llama adenosina desaminasas que actúan sobre el ARN o ADAR. Los ADAR son enzimas que se unen a moléculas de ARN de doble cadena (dsRNA) y hacen una edición de base específica, convirtiendo una molécula de adenosina (A) no coincidente en inosina (I). Este cambio desestabiliza la estructura del dsRNA y se cree que está involucrado en las respuestas de las células a diferentes virus, muchos de los cuales llevan su material genético en forma de ARN.

Los investigadores razonaron que podrían usar la capacidad natural de edición de dsRNA de los ADAR para crear un nuevo tipo de sensor de ARN sensible. Así que diseñaron un circuito de ARN monocatenario que contenía múltiples elementos modulares:

• Una secuencia complementaria a un ARN de interés en una célula
• Una secuencia de codón de « terminación » de uracilo-adenosina-guanina (UAG) en el medio de la cadena de ARN
• Una secuencia que codifica una proteína verde fluorescente como una molécula de señal observable

La secuencia del codón UAG evita que cualquier gen codificado después de ella, como la proteína verde fluorescente, se traduzca, ya que UAG es la señal natural para un ribosoma de que debe detener el proceso de traducción y desprenderse de una cadena de ARN. Sin embargo, si el circuito se une a una cadena de ARN diana complementaria en la célula, se convierte en una molécula de ARN de doble cadena. El equipo diseñó su circuito para que la A de la secuencia UAG « no coincida » con una citosina (C) en la hebra objetivo, en lugar de con su socio legítimo de U. Este desajuste esencialmente libera la A para encontrarla y convertirla en I. por ADAR, y la secuencia UIG resultante ya no es un codón de « terminación », lo que permite que se produzca la traducción. Por lo tanto, se produce la proteína fluorescente verde, lo que indica que el circuito del sensor ha encontrado y se ha unido a su objetivo.

Los ADAR se encuentran naturalmente en altas concentraciones en las neuronas, pero en cantidades bajas en otras células, y el equipo descubrió que, si bien su sensor basado en ADAR funcionaba, su actividad era baja. Para asegurarse de que el sensor pudiera funcionar en diferentes tipos de células, agregaron la secuencia del gen ADAR a sus sensores. Ahora, la activación del sensor por ADAR naturalmente presente en una célula podría estimular la producción de más ADAR, creando un ciclo de retroalimentación positiva que amplifica la actividad del sensor. Verificaron que esto ocurrió en experimentos in vitro, observando que las células que recibieron el sensor DART VADAR que contenía ADAR mostraron un marcado aumento en los niveles de proteína verde fluorescente.

« Lo que es realmente emocionante de este sensor es que la secuencia señal de la proteína verde se puede reemplazar fácilmente con la secuencia de cualquier gen terapéutico que desee expresar en respuesta a la presencia de un ARN desencadenante en la célula. Por lo tanto, este sensor no solo detecta objetivos, puede responder automáticamente a ellos sin requerir la entrada del usuario, automatizando la entrega de una carga útil terapéutica a nivel celular », dijo el coautor principal Shiva Razavi, Ph.D. becario postdoctoral en el MIT.

Un sensor de alta sensibilidad

« Aunque la expresión de ADAR natural a través de nuestro sensor aumentó la tasa de edición de A a I de aproximadamente un 3 % a aproximadamente un 30 %, eso todavía no llega a ser útil en un contexto del mundo real. El ADAR endógeno es insuficiente para generar resultados consistentes y demasiado grande para caber en vehículos de entrega clínicamente aprobados, como AAV. En términos de potencial de traducción, es importante asegurarse de que cualquier cosa que esté haciendo en el laboratorio pueda convertirse de manera realista en un producto algún día », dijo la coautora Katherine Ilia, Ph.D. investigadora postdoctoral en el MIT.

Para probar el rendimiento de su sistema DART VADAR optimizado con su enzima diseñada, el equipo decidió ver si podía detectar una mutación de base única en el tumor p53 humano.

Luego probaron si DART VADAR podía distinguir entre células sanas que se encuentran en diferentes etapas de desarrollo, en función de la presencia de marcadores moleculares específicos del estado celular. Utilizaron células de ratón llamadas mioblastos, que son células progenitoras que pueden diferenciarse en múltiples tipos de células, incluidos miotubos (que se convierten en músculo) y osteoblastos (que producen hueso). Diseñaron sensores DART VADAR para detectar marcadores de ARN de ambos destinos celulares, presionaron a los mioblastos para que se diferenciaran y luego agregaron sus sensores a las células. Descubrieron que ambos sensores producían fuertemente sus respectivas moléculas de señal de carga útil en sus células correspondientes, lo que demuestra que los sensores pueden detectar diferencias moleculares tanto en los estados como en los tipos de células.

El equipo señala que para aplicar DART VADAR a varias aplicaciones clínicas, se deberán considerar aspectos adicionales del sitio objetivo, como la probabilidad de desencadenar una respuesta inmune, durante el proceso de desarrollo del sensor. Anticipan que los avances computacionales recientes en la predicción de la estructura de proteínas podrían usarse para refinar aún más la selección de sitios objetivo óptimos para guiar el diseño de sensores DART VADAR seguros y efectivos. Solicitaron una subvención para usar DART VADAR para explorar la diferenciación gradual de células madre en otros tipos de células, que en el futuro podrían usarse para reemplazar las células enfermas en un paciente con células sanas.

« La capacidad de este equipo para combinar componentes biológicos preexistentes en una tecnología de ingeniería completamente nueva que tiene el potencial de hacer que el tratamiento de una amplia gama de enfermedades sea más rápido y fácil es un gran ejemplo de cómo la biología sintética puede cambiar el mundo para mejor », dijo. Director Fundador de Wyss Don Ingber, MD, Ph.D. Ingber también es profesor Judah Folkman de Biología Vascular en la Facultad de Medicina de Harvard y el Hospital Infantil de Boston, y profesor Hansjörg Wyss de Ingeniería Bioinspirada en la Facultad de Ingeniería y Ciencias Aplicadas John A. Paulson de Harvard.

Nathaniel Tippens es otro coautor del artículo. Otros autores incluyen a Makoto Lalwani, Kehan ​​Zhang y Jack Chen del Instituto Wyss y el MIT, Jonathan Chen del MIT y el Instituto Broad, y José Vargas-Asencio del Instituto Picower del MIT. Este trabajo fue apoyado por subvenciones NIH R01EB024591 y 5RC2DK120535-03, y el Instituto Wyss de Ingeniería Biológicamente Inspirada.