Dentro de una célula viva, las proteínas y otras moléculas suelen estar muy juntas. Estos cúmulos densos pueden ser difíciles de visualizar porque las etiquetas fluorescentes que se usan para hacerlos visibles no pueden encajarse entre las moléculas.

Los investigadores del MIT ahora han desarrollado una nueva forma de superar esta limitación y hacer visibles esas moléculas «invisibles». Su técnica les permite «desagrupar» las moléculas expandiendo una muestra de tejido o célula antes de etiquetar las moléculas, lo que hace que las moléculas sean más accesibles a las etiquetas fluorescentes.

Este método, que se basa en una técnica ampliamente utilizada conocida como microscopía de expansión desarrollada previamente en el MIT, debería permitir a los científicos visualizar moléculas y estructuras celulares que nunca antes se habían visto.

«Cada vez está más claro que el proceso de expansión revelará muchos nuevos descubrimientos biológicos. Si los biólogos y los médicos han estado estudiando una proteína en el cerebro u otro espécimen biológico, y la están etiquetando de la manera habitual, es posible que se estén perdiendo categorías enteras de fenómenos». «, dice Edward Boyden, profesor Y. Eva Tan en Neurotecnología, profesor de ingeniería biológica y ciencias cognitivas y del cerebro en el MIT, investigador del Instituto Médico Howard Hughes y miembro del Instituto McGovern para la Investigación del Cerebro del MIT y del Instituto Koch para la Integración Investigación sobre el cáncer.

Usando esta técnica, Boyden y sus colegas demostraron que podían obtener imágenes de una nanoestructura que se encuentra en las sinapsis de las neuronas. También obtuvieron imágenes de la estructura de las placas de beta amiloide vinculadas al Alzheimer con mayor detalle de lo que había sido posible antes.

«Nuestra tecnología, a la que llamamos revelación de expansión, permite la visualización de estas nanoestructuras, que antes permanecían ocultas, utilizando hardware fácilmente disponible en laboratorios académicos», dice Deblina Sarkar, profesora asistente en Media Lab y una de las autoras principales del estudio..

Los autores principales del estudio son Boyden; Li-Huei Tsai, director del Instituto Picower para el Aprendizaje y la Memoria del MIT; y Thomas Blanpied, profesor de fisiología de la Universidad de Maryland. Otros autores principales incluyen a Jinyoung Kang, un postdoctorado del MIT, y Asmamaw Wassie, un reciente doctorado del MIT. El estudio aparece hoy en Nature Biomedical Engineering.

despoblamiento

La obtención de imágenes de una proteína específica u otra molécula dentro de una célula requiere etiquetarla con una etiqueta fluorescente que lleva un anticuerpo que se une al objetivo. Los anticuerpos miden alrededor de 10 nanómetros de largo, mientras que las proteínas celulares típicas suelen tener entre 2 y 5 nanómetros de diámetro, por lo que si las proteínas objetivo están demasiado empaquetadas, los anticuerpos no pueden llegar a ellas.

Esto ha sido un obstáculo para las imágenes tradicionales y también para la versión original de la microscopía de expansión, que Boyden desarrolló por primera vez en 2015. En la versión original de la microscopía de expansión, los investigadores adhirieron etiquetas fluorescentes a las moléculas de interés antes de expandir el tejido. El etiquetado se realizó primero, en parte porque los investigadores tuvieron que usar una enzima para cortar las proteínas en la muestra para que el tejido pudiera expandirse. Esto significaba que las proteínas no podían etiquetarse después de expandir el tejido.

Para superar ese obstáculo, los investigadores tuvieron que encontrar una manera de expandir el tejido dejando las proteínas intactas. Usaron calor en lugar de enzimas para ablandar el tejido, lo que permitió que el tejido se expandiera 20 veces sin destruirse. Luego, las proteínas separadas podrían etiquetarse con etiquetas fluorescentes después de la expansión.

Con tantas más proteínas accesibles para el etiquetado, los investigadores pudieron identificar pequeñas estructuras celulares dentro de las sinapsis, las conexiones entre las neuronas que están repletas de proteínas. Etiquetaron y obtuvieron imágenes de siete proteínas sinápticas diferentes, lo que les permitió visualizar, en detalle, «nanocolumnas» que consisten en canales de calcio alineados con otras proteínas sinápticas. Estas nanocolumnas, que se cree que ayudan a que la comunicación sináptica sea más eficiente, fueron descubiertas por primera vez por el laboratorio de Blanpied en 2016.

«Esta tecnología se puede usar para responder muchas preguntas biológicas sobre la disfunción en las proteínas sinápticas, que están involucradas en enfermedades neurodegenerativas», dice Kang. “Hasta ahora no ha habido ninguna herramienta para visualizar muy bien las sinapsis”.

Nuevos patrones

Los investigadores también utilizaron su nueva técnica para obtener imágenes de beta amiloide, un péptido que forma placas en los cerebros de los pacientes de Alzheimer. Usando tejido cerebral de ratones, los investigadores encontraron que la beta amiloide forma nanoclusters periódicos, que no se habían visto antes. Estos grupos de beta amiloide también incluyen canales de potasio. Los investigadores también encontraron moléculas de beta amiloide que formaban estructuras helicoidales a lo largo de los axones.

«En este artículo, no especulamos sobre lo que podría significar esa biología, pero mostramos que existe. Ese es solo un ejemplo de los nuevos patrones que podemos ver», dice Margaret Schroeder, una estudiante graduada del MIT que está también autor del artículo.

Sarkar dice que está fascinada con los patrones biomoleculares a nanoescala que revela esta tecnología. «Con experiencia en nanoelectrónica, he desarrollado chips electrónicos que requieren una alineación extremadamente precisa, en la nanofabrica. Pero cuando veo que en nuestro cerebro la Madre Naturaleza ha dispuesto biomoléculas con tal precisión a nanoescala, realmente me sorprende», dice.

Boyden y los miembros de su grupo ahora están trabajando con otros laboratorios para estudiar estructuras celulares como los agregados de proteínas relacionados con el Parkinson y otras enfermedades. En otros proyectos, están estudiando patógenos que infectan células y moléculas involucradas en el envejecimiento del cerebro. Los resultados preliminares de estos estudios también han revelado nuevas estructuras, dice Boyden.

«Una y otra vez, ves cosas que son realmente impactantes», dice. «Nos muestra cuánto nos falta con la tinción clásica sin expandir».

Los investigadores también están trabajando en la modificación de la técnica para que puedan obtener imágenes de hasta 20 proteínas a la vez. También están trabajando en la adaptación de su proceso para que pueda usarse en muestras de tejido humano.

Sarkar y su equipo, por otro lado, están desarrollando diminutos dispositivos nanoelectrónicos inalámbricos que podrían distribuirse en el cerebro. Planean integrar estos dispositivos con expansión reveladora. «Esto puede combinar la inteligencia de la nanoelectrónica con la destreza nanoscópica de la tecnología de expansión, para una comprensión funcional y estructural integrada del cerebro», dice Sarkar.

La investigación fue financiada por los Institutos Nacionales de Salud, la Fundación Nacional de Ciencias, la Fundación de la Familia Ludwig, la Fundación JPB, el Proyecto de Filantropía Abierta, John Doerr, Lisa Yang y el Centro Tan-Yang para la Investigación del Autismo en el MIT, el Ejército de EE. UU. Oficina de Investigación, Charles Hieken, Tom Stocky, Kathleen Octavio, Lore McGovern, Good Ventures y HHMI.