Expertos de la Universidad de Barcelona, el Instituto de Química Avanzada de Cataluña (IQAC-CSIC), el Instituto de Microelectrónica de Barcelona (IMB-CNM-CSIC) y el Instituto Aragonés de Nanociencia y Materiales de Aragón (INMA), instituto mixto del CSIC y la Universidad de Zaragoza- han desarrollado un nuevo método para detectar virus de ARN basado en la tecnología de sonda formadora de triplex. Esta innovadora metodología abre nuevas opciones para la detección de virus como el SARS-CoV-2, el virus de la gripe A (H1N1) o el virus respiratorio sincitial (VSR), un patógeno que afecta a los recién nacidos y requiere un cuidadoso diagnóstico diferencial.
Este estudio interdisciplinar, publicado en International Journal of Molecular Sciences, está liderado por Carlos J. Ciudad y Verónica Noe, de la Facultad de Farmacia y Ciencias de la Alimentación y del Instituto de Nanociencia y Nanotecnología (IN2UB) de la Universidad de Barcelona; Ramón Eritja, Anna Aviñó, Lluïsa Vilaplana y M. Pilar Marco, del IQAC-CSIC y CIBER de Bioingeniería, Biomateriales y Nanomedicina (CIBER-BBN); Manuel Gutiérrez, Antoni Baldi y César Fernández, del IMB-CNM-CSIC, y Valeria Grazu y Jesús Martínez, investigadores del CSIC en el Instituto de Nanociencia y Materiales e INMA de Aragón (CSIC-UNIZAR) y el CIBER-BBN.
El estudio se ha realizado en el contexto del proyecto PoC4CoV, liderado por M. Pilar Marco y César Fernández y financiado a través de la Plataforma Salud Global (PTI) del CSIC. El estudio de investigación ha continuado en el marco de un proyecto financiado por La Marató de TV3 2020 para luchar contra la COVID-19, en el que también participan expertos de la Facultad de Química de la UB.
Horquillas de polipurina para capturar ARN viral
La nueva metodología se basa en la capacidad de las horquillas de polipurina (PPRH), diseñadas por el grupo de terapia del cáncer de la UB, para capturar el ARN viral y formar un triplex de alta afinidad. Cuando esta estructura híbrida se conecta a una sonda molecular y se pone en contacto con la muestra del paciente afectado, se obtiene una señal de detección del agente viral. El método presentado en la publicación científica se denomina Ensayo de detección de ácido nucleico mejorado Triplex (TENADA).
« Los PPRH son horquillas de ADN monocatenario no modificadas que consisten en dos dominios especulares de polipurinas antiparalelas. Estos dominios, conectados entre sí por un bucle de timidina, están unidos por enlaces Hoogsteen inversos intramoleculares. Las horquillas moleculares pueden unirse específicamente a secuencias de polipirimidina en un solo virus de ADN bicatenario (ssDNA), ADN bicatenario (dsDNA) o ARN a través de enlaces Watson-Crick, formando así un triplex antiparalelo”, explica el profesor Carlos J. Ciudad, del Departamento de Bioquímica y Fisiología de la UB.
Una metodología eficaz y más rápida que el test PCR
Una ventaja en la detección de ARN viral es que la metodología PPRH se puede aplicar sin la intervención de la transcriptasa inversa, la enzima que convierte el ARN en ADN, o el termociclador (el dispositivo que amplifica muestras de material genético con la reacción en cadena de la polimerasa). o PCR). Además, tiene una sensibilidad y especificidad equivalente a la de la prueba PCR y puede dar resultados en menos de una hora.
Como parte del estudio, el equipo utilizó la estrategia de hibridación en sándwich en varios dispositivos de biodetección. Esta estrategia utiliza dos oligonucleótidos: una horquilla de PPRH formadora de tríplex que actúa como sonda de captura y un oligonucleótido de ADN formador de dúplex marcado que actúa como sonda de detección.
« Las horquillas de PPRH que forman triplex se diseñaron para unirse a las secuencias de polipirimidina del SARS-CoV-2, mientras que las sondas de detección se diseñaron como complementarias a una región cercana al sitio objetivo de las polipirimidinas. Por lo tanto, la presencia del SARS-CoV-2 El ARN se detecta por la formación del complejo ternario en la superficie del biosensor”, explica la profesora Verónica Noé (UB-IN2UB).
Esta metodología se ha implementado en un dispositivo electroquímico compacto que integra una celda electroquímica de dos electrodos en un chip -fabricado en la Sala Limpia de Micro y Nanofabricación IMB-CNM-CSIC- y un componente fluídico en papel, y en un lateral térmico sistema de flujo implementado en nitrocelulosa y utilizando nanopartículas plasmónicas y papel térmico que ha sido desarrollado en INMA (CSIC-UNIZAR).
TENADA : aplicaciones en investigación biomédica
Los PPRH se describen en la literatura científica como herramientas para el silenciamiento génico de varios genes implicados principalmente en el cáncer. Además, también se han incorporado como sondas en biosensores para la detección de pequeñas moléculas de ARN (miARN) para determinar el estado de metilación del ADN y para el diagnóstico de neumonía provocada por el hongo Pneumocystis jirovecii.
Ahora, la nueva metodología TENADA demuestra ser efectiva no solo en la detección de partículas virales. La alta afinidad de los PPRH por el ARN viral es una propiedad que se puede aplicar para inhibir el proceso de replicación del virus. Por ello, ahora también se están estudiando las propiedades antivirales de las horquillas de polipurina CC1PPRH y CC2PPRH en células del linaje VeroE6 infectadas con viriones del SARS-CoV-2.
Además, el trabajo realizado por los diferentes grupos implicados también ha sido la base de una tecnología que fue patentada y licenciada en julio de 2022 a través de la participación del Centro de Patentes de la UB, el CSIC y el CIBER-BBN. Además, esta patente ha sido licenciada con carácter no exclusivo a la empresa española Nanoinmunotech a través de la dirección de la Fundación Bosch i Gimpera (FBG-UB) en el proceso de protección de la tecnología y contrato de licencia de la empresa.