En la búsqueda de imágenes de estructuras y fenómenos extremadamente pequeños con mayor precisión, los científicos han estado empujando los límites de la resolución del microscopio óptico, pero estos avances a menudo conllevan una mayor complicación y costo.

Ahora, investigadores en Japón han demostrado que una superficie de vidrio incrustada con nanopartículas de oro autoensambladas puede mejorar la resolución con un costo adicional mínimo incluso utilizando un microscopio de campo amplio convencional, lo que facilita la microscopía de fluorescencia de alta resolución capaz de obtener imágenes de alta velocidad de células vivas.

Debido a que los microscopios ópticos aumentan la luz para obtener imágenes detalladas de una estructura, el tamaño de los objetos que se pueden distinguir ha estado limitado durante mucho tiempo por la difracción, una propiedad de la luz que hace que se propague al pasar a través de una abertura.

Los investigadores han estado desarrollando técnicas para superar estos límites con sistemas ópticos muy avanzados, pero muchos de ellos dependen del uso de láseres potentes, que pueden dañar o incluso matar células vivas, y el escaneo de la muestra o el procesamiento de múltiples imágenes, lo que inhibe las imágenes reales. -tiempo de imágenes.

«Las técnicas recientes pueden producir imágenes asombrosas, pero muchas de ellas requieren equipos altamente especializados y son incapaces de observar el movimiento de las células vivas», dice Kaoru Tamada, profesor distinguido del Instituto de Química e Ingeniería de Materiales de la Universidad de Kyushu.

Al obtener imágenes de células utilizando métodos de microscopía de fluorescencia en tiempo real, Tamada y su grupo descubrieron que podían mejorar la resolución con un microscopio de campo amplio convencional para acercarse al límite de difracción simplemente cambiando la superficie debajo de las células.

En la microscopía de fluorescencia, las estructuras celulares de interés se marcan con moléculas que absorben energía de la luz entrante y, a través del proceso de fluorescencia, la reemiten como luz de un color diferente, que se recoge para formar la imagen.

Aunque las imágenes de las células generalmente se toman en vidrio simple, el grupo de Tamada cubrió la superficie del vidrio con una capa autoensamblada de nanopartículas de oro cubiertas con una capa delgada de dióxido de silicio, creando una llamada metasuperficie con propiedades ópticas especiales.

Con solo 12 nm de diámetro, las nanopartículas de metal organizadas exhiben un fenómeno conocido como resonancia de plasmón de superficie localizada, que permite que la metasuperficie recolecte energía de moléculas emisoras de luz cercanas para una reemisión altamente eficiente, produciendo así una emisión mejorada confinada a los 10 nm. superficie gruesa de nanopartículas.

«Al introducir las nanopartículas, hemos creado efectivamente un plano emisor de luz que tiene solo varios nanómetros de espesor», explica Tamada. «Debido a que la luz de interés se emite desde una capa tan delgada, podemos enfocarnos mejor en ella».

Los beneficios adicionales surgen de que la transferencia de energía a la metasuperficie es rápida, lo que localiza aún más los puntos de emisión al reducir la difusión, y el alto índice de refracción de la metasuperficie, que ayuda a mejorar la resolución de acuerdo con el límite de difracción de Abbe.

Usando la metasuperficie, los investigadores obtuvieron imágenes de células de ratón en tiempo real conocidas como fibroblastos 3T3 que fueron modificadas genéticamente para producir una proteína llamada paxilina que se modifica para emitir luz verde cuando se excita. La paxilina juega un papel clave en la creación de adherencias focales, puntos donde las moléculas de la membrana celular interactúan con el mundo exterior.

Al iluminar toda la muestra con luz láser perpendicular a la superficie, los investigadores pudieron visualizar cambios en la paxilina cerca de la membrana celular con una resolución más alta utilizando la metasuperficie en lugar de vidrio.

Al inclinar la luz de iluminación para lograr una reflexión interna total, los investigadores pudieron obtener imágenes con un contraste aún mayor porque la mayor parte de la luz de iluminación se refleja en la superficie y solo una pequeña cantidad llega al lado de la celda, lo que reduce la emisión parásita producida por la iluminación que penetra profundamente en la célula.

El análisis de las imágenes grabadas cada 500 milisegundos con una cámara digital de superresolución reveló claras diferencias de intensidad en puntos que cubren solo unos pocos píxeles, lo que indica que la resolución era de unos 200 nm, cerca del límite de difracción.

También se pudieron obtener imágenes de las células durante más tiempo en la metasuperficie porque la emisión se mejoró a pesar de una menor energía de entrada, reduciendo así el daño celular con el tiempo.

«Las metauperficies son una opción prometedora para mejorar la resolución para los investigadores de todo el mundo que utilizan microscopios ópticos convencionales que ya tienen», comenta Tamada.

Además de continuar mejorando las superficies para su uso con microscopios convencionales, los investigadores también están explorando las ventajas que pueden tener para sistemas de microscopios más sofisticados.